Cốt truyện

Sau khi thoát khỏi cuộc tấn công của các Templar trong Assassin Creed II, Desmond Miles, Lucy Stillman, Rebecca Crane và Shaun Hastings trốn đến Monteriggioni, thiết lập một nơi ẩn náu mới trong đống đổ nát của biệt thự Auditore. Sau khi khôi phục hệ thống điện trong đường hầm cũ dưới căn biệt thự, các Assassin lại tiếp tục truy cập vào ký ức của Ezio Auditore bằng cỗ máy Animus 2.0 (cũng là giao diện bộ nhớ của trò chơi). Nhiệm vụ của họ là tiếp tục tìm kiếm tung tích của Apple of Eden, một vật quan trọng và bí ẩn có thể ngăn chặn các thảm họa sắp xảy ra.

Câu chuyện của Ezio vẫn tiếp tục từ năm 1499, sau khi anh vào được Vault và gặp Minerva. Ezio lấy lại Apple of Eden (được anh dùng trong phần trước để vào Vault) và cùng với chú của mình là Mario Auditore trốn thoát khỏi Rome trở về thị trấn Monteriggioni. Khi về nhà, Ezio thông báo với các thành viên Assassins rằng cuộc báo thù của mình đã kết thúc; tuy nhiên Niccolò Machiavelli không bằng lòng với quyết định tha chết cho Rodrigo Borgia (nay là Giáo hoàng Alexander VI) của Ezio. Sáng hôm sau, Monteriggioni bị quân của Cesare Borgia, con trai của Rodrigo bao vây và tấn công hủy diệt. Cesare giết chết Mario và chiếm lại Apple. Ezio cùng với gia đình của mình chạy thoát và một lần nữa đến Rome, trung tâm quyền lực của Templar ở Ý, một lần nữa tìm cách báo thù chống lại Borgias. Ở đó, anh nhận thấy các Assassins đang thất bại trong cuộc chiến chống tham nhũng. Quyết tâm xây dựng lại Hội, Ezio thuyết phục Machiavelli rằng anh có thể phát triển ở Rome một hội Huynh đệ (Brotherhood) đủ mạnh để tiêu diệt các Templar và kẻ thù mới Cesare.

Trong bốn năm tiếp theo, Ezio thực hiện nhiều cách thức khác nhau nhằm tê liệt ảnh hưởng của Borgias ở Rome, phá hoại sức mạnh của Cesare và ám sát những nhân vật thân cận của hắn, từng bước giúp Rome khôi phục lại vinh quang trước đây và trở thành người lãnh đạo cao nhất của Assassin Order tại Ý. Trong thời gian này, em gái của Ezio là Claudia cũng được kết nạp và trở thành một Assassin.

Cesare ngày càng yêu cầu Rodrigo cung ứng thêm tiền và thậm chí đòi sở hữu cả Apple. Rodrigo từ chối và cố gắng đầu độc con trai của mình khi nhận ra ham muốn quyền lực ngày một lớn của hắn. Tuy nhiên Cesare lại cao tay hơn và dùng cách tương tự để giết Rodrigo. Ezio tận mắt chứng kiến cảnh đó và biết được Apple đang được giấu bên trong   Thánh Đường St.Phêrô. Anh lấy lại Apple và sử dụng nó áp đảo lực lượng của Cesare; Cesare bị quân của Giáo hoàng Julius II bắt và tống giam. Một thời gian sau, hắn ta được vua John III của Navarre giải thoát và đem quân bao vây thành phố Viana. Ezio truy sát Cesare và giết hắn trên mặt thành một lâu đài đổ nát. Sau đó anh đem Apple giấu vào trong một First Civilization Temple (Ngôi đền của Nền văn minh Đầu tiên) bên dưới nhà thờ Santa Maria ở Aracoeli.

Sử dụng tọa độ lấy từ ký ức của Ezio, Desmond, Lucy, Shaun và Rebecca đến ngôi đền; họ định dùng Apple xác định vị trí các ngôi đền còn lại nhằm giữ các mảnh Eden xa khỏi bàn tay của Templar. Desmond tìm cách vào được đền thờ, anh gặp một ảnh nổi ba chiều của Juno, một người cùng chủng tộc với Minerva; tuy bà ta không thể nghe hay nhìn thấy Lucy, Shaun, hay Rebecca. Khác với Minerva, Lucy cho rằng nhân loại là "ngây thơ và ngu dốt". Desmond tiếp cận được Apple và chạm tay vào nó, thời gian bỗng trở nên đóng băng, mặc dù anh vẫn có thể di chuyển và nói chuyện. Juno không chấp nhận Desmond là hậu duệ mà là kẻ thù của chủng tộc bà ta; bà ta cũng nói rằng có một người phụ nữ đi cùng Desmond đi qua "cánh cổng" mà chưa được phép. Juno điều khiển cơ thể Desmond và buộc anh phải đâm vào bụng Lucy. Cả hai rơi xuống mặt đất, Lucy chết và Desmond rơi vào tình trạng hôn mê. Trò chơi kết thúc bằng giọng của hai người đàn ông đang thảo luận về việc có nên đưa Desmond trở lại Animus.